1.X线所见
腹部立位平片多显示低位结肠梗阻，钡剂灌肠侧位和前后位照片中可见到典型的痉挛肠段和扩张肠段，排钡功能差，24小时后仍有钡剂存留，若不及时灌肠洗出钡剂，可形成钡石，合并肠炎时扩张肠段肠壁呈锯齿状表现，新生儿时期扩张肠管多于生后半个月方能对比见到，若仍不能确诊则进行以下检查。
①倒立侧位X线平片
称为Wangenst-een-Rice法，要求在生后12小时以上摄片，等待气体到达直肠，生活能力差者需要更长时间，在会阴肛门区皮肤上涂钡剂作为标记，摄片前将婴儿倒立2～3分钟，使直肠盲端的胎便与肠管气体互相转换，采取髋关节呈90°屈曲位，使保持能充分显示P点(耻骨中心)，C点(骶尾关节)，I点(坐骨最低点)的角度，以股骨大粗隆为中心，在呼气，吸气及啼哭时各摄片1张。
通过I点设一与PC线相平行的I线，与PC线间的距离为肛提肌群，直肠盲端位于PC线上方者为高位，于二线之间为中间位，超越I线为低位，或者设置M点，即坐骨结节的上2/3与下1/3交接点，在M线上方者为中间位，M线下方者为低位。
但必须注意各种影响因素，如肠道充气不足，胎便过于粘稠，肛提肌的运动，X线投照角偏斜等均能影响位置的正确性。
②瘘管造影
瘘管造影要求显示造影剂注入时的结肠影象及造影剂排出时的直肠瘘管影象，结肠直肠与尿道双重造影可显示直肠瘘管与尿道的关系，阴道造影可显示阴道与直肠的关系。
婴儿出生后仔细观察会阴部即可发现在正常肛门位置没有肛门，特别是生后24小时不排胎便，就应及时检查，如能早期发现，其临床表现为不同程度的低位肠梗阻症状，在无瘘的或伴有狭小瘘管的病例，往往在出生后早期即发生急性完全性低位肠梗阻症状，在肛门直肠狭窄或伴有较大瘘管的病例，依据其狭窄程度和瘘管大小，可在几周，几月甚至几年后出现排便困难，便秘，粪石形成，继发巨结肠等慢性梗阻症状。
2.活体组织检查
取距肛门4cm以上直肠壁粘膜下层及肌层一小块组织，检查神经节细胞的数量，巨结肠患儿缺乏节细胞。
3.肛门直肠测压法
测定直肠和肛门括约肌的反射性压力变化，可诊断先天性巨结肠和鉴别其他原因引起的便秘，在正常小儿和功能性便秘，当直肠受膨胀性刺激后，内括约肌立即发生反射性放松，压力下降，先天性巨结肠患儿内括约肌非但不放松，而且发生明显的收缩，使压力增高，此法在10天以内的新生儿有时可出现假阳性结果。
4.直肠粘膜组织化学检查法
此乃根据痉挛段粘膜下及肌层神经节细胞缺如处增生，肥大的副交感神经节前纤维不断释放大量乙醯胆碱和胆碱酶，经化学方法可以测定出两者数量和活性均较正常儿童出5～6倍，有助于对先天性巨结肠的诊断，并可用于新生儿。
