因为黄杆菌感染的临床表现特异性不强，单纯从临床表现判断出是本菌感染是困难的，必须迅速取得标本，分离该菌，以血液琼脂或麦康凯琼脂平板，30℃培养18～24h挑取可疑菌落接种TSI，30℃ 24h培养，高层和斜面不产酸，氧化酶阳性，菌苔黄色，略带黏性，可疑黄杆菌，待进一步鉴定，下一步是定属，O-F试验为氧化型，产黄色素(少数不产生)，不扩散至培养基内;无动力，无芽孢;具有氧化酶和过氧化氢酶;革兰阴性杆菌或球杆菌，再下一步是定种，以生化试验确定菌种，重要的是上述脑膜脓毒黄杆菌与6群黄杆菌的鉴定，上已述及。
如果细菌培养结果不能确诊，本病诊断就十分困难，临床上须与各种革兰阴性杆菌性肺炎鉴别，铜绿假单胞菌肺炎痰呈草绿色或黄绿色，痰一般不如黄杆菌黏稠且量很大，在细菌培养时铜绿假单胞菌可产生特殊的气味，菌落呈蓝绿，黄绿色，芳香产碱杆菌所致肺炎有时与芳香黄杆菌肺炎相似，应注意区别，前者痰为灰色脓样，临床病情不如黄杆菌类凶险，在有慢性纤维空洞型肺结核的患者，合并黄杆菌感染时容易误认为结核复发，应注意反复进行痰细菌培养，早日确定感染菌种，本病胸腔积液较常见，浆液性或血性胸水也应常规进行细菌培养，阳性检出率很高，本病易合并败血症和脑膜炎，常规的血培养和脑脊液细菌培养均有助于与其他细菌感染区别。
